Загрязнение кормов для животных микотоксинами, активное использование антибактериальных средств в животноводстве, повышение требований к пищевой ценности и подлинности молока, определяет необходимость выбора оптимальных методов аналитического контроля качества и безопасности молока, учитывая при этом доступность и воспроизводимость методик, оперативность получения результатов, экономические и иные факторы.

Низкий уровень предельно-допустимой концентрации афлатоксина М1 (не более 0,0005 мг/л, в продуктах детского питания - не допускается), запрет присутствия антибиотиков в пищевых продуктах [1], необходимость маркировки количества витаминов в продуктах детского питания требует организации высоко-квалифицированных лабораторий на предприятиях молочной промышленности. Для проведения анализа физико-химическими методами, как правило нужна многостадийная очистка субстратов, которая занимает много времени, приводит к потерям анализируемого вещества и увеличению ошибки анализа. Наиболее распространенный метод контроля этих веществ - высокоэффективная жидкостная хроматография (далее ВЭЖХ) предполагает наличие дорогостоящего оборудования и использование реактивов высокой степени очистки, что существенно сказывается на конечной стоимости анализа.

В последнее десятилетие наблюдается быстрое внедрение иммунохимических методов анализа (преимущественно, иммуноферментного метода, далее - ИФА) в лабораторную практику, связанное с усовершенствованием техники такого анализа и обусловленное потребностью в быстрых, чувствительных, специфичных, производительных и простых методах.

Метод ИФА (или ELISA) был предложен в начале 70-х годов тремя независимыми группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотр. в США [2].

Отличительными особенностями метода является высокая чувствительность, специфичность, высокая производительность, экспрессность, возможность использования минимально очищенных экстрактов, сравнительно низкая стоимость оборудования.

Метод основан на специфическом воздействии антигена (загрязняющего вещества) и антитела (полученного против контролируемого вещества). Образующийся комплекс антиген-антитело после его мечения ферментом детектируется по цветной реакции с помощью простых измерительных приборов.

Для контроля молока, как в зарубежной практике, так и в России уже широко используется иммуноферментный анализ. Для подтверждения результатов анализа применяется метод иммуноаффинной очистки с последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Огромное значение для его дальнейшего распространения имеет серийное производство высококачественных компонентов для иммуноферментного анализа - антител и коньюгатов, а также комплектных тест-систем для ИФА, выпускающихся под контролем системы качества ISO9000

Большой спектр тест-систем представлен серией RIDASCREEN FAST, RIDASCREEN и RIDA (Таблица 1), с помощью которых исследование молока по показателям качества и безопасности может быть выполнено за короткое время [3], причем возможно как количественное определение, так и полуколичественный анализ при визуальном учете результатов.

Таблица 1. Некоторые серийно выпускающиеся тест-системы и иммуноаффинные колонки для анализа молока

Наименование тест-системы Предел обнаружения Время пробоподготовки /анализа

Определение афлатоксина М1

Иммуноаффинные колонки AFLAPREP M Определяется ВЭЖХ 40 мин

Иммуноаффинные колонки RIDA Aflatoxin Определяется ВЭЖХ 40 мин

RIDASCREEN^® Афлатоксин М1, 96 опр. < 0.00001 мкг/кг (молоко)
< 0.0001 мкг/кг (сыр) 0.5 (молоко); 2 (сыр) / 3 часа

RIDASCREEN^® FAST Афлатоксин М1, 48 опр. 0.00025 мкг/кг 5 мин / 15 мин

Определение антибиотиков и других антибактериальных препаратов

RIDASCREEN^® Левомицетин, 96 опр. 0,0125 мкг/кг 10 мин/3 часа

RIDASCREEN^® Тетрациклин, 96 опр. 1,5 мкг/л 30 мин/1,5 часа

RIDASCREEN^® Стрептомицин, 96 опр. 20 мкг/л 1 час / 3 часа

RIDASCREEN^® Сульфамезин, 96 опр. 10 мкг/л 30 мин/3 часа

RIDASCREEN^® FAST Сульфамезин, 48 опр. 10 мкг/л 20 мин/ 20 мин

RIDASCREEN^® Нитрофураны, 96 опр. 0,1 мкг/л 2+16+ 2 ч/1.5 ч

RIDASCREEN^® Фторхинолоны, 96 опр. 1 мкг/л 1 час 15 мин

Определение витаминов

RIDASCREEN^® FAST Витамин В₁₂, 48 опр. 0,5 мкг/л 30 мин/30 мин

Иммуноаффинная колонка EASI-EXTRACT Витамин В12 Пробоподготовка перед ВЭЖХ 20 мин

RIDASCREEN^® FAST Фолиевая кислота, 48 опр. 10 мкг/л 30 мин/30 мин

RIDASCREEN^® Биотин, 96 опр. 0,3 мкг/л 3 часа/ 1.5 часа

Тест-системы серии Vita^® FAST для определения тиамина (В1), рибофлавина (В2), ниацина (В3), пантотеновой кислоты (В5), пиридоксина (В6), биотина (В7), фолиевой кислоты (В9), цианкобаламина (В12), инозитола, холина Превышает требования СанПиН по пищевой ценности продуктов питания 48 часов

Определение энтеротоксинов стафилококка

0,2 мкг/л 1 час/2.5 часа

Определение подлинности

RIDASCREEN^® Казеин, 48 опр. 0,5% коровьего казеина 2 часа/2,5 часа

RIDASCREEN^® CIS, 48 опр. 0,1% коровьего молока в козьем или овечьем молоке (сыре) 10 мин/1.5 часа

RIDA^® Quick CIS, 25 опр. 0,5 % коровьего молока в козьем или овечьем молоке (сыре) 10 мин

RIDASCREEN^® GIS, 48 опр. 0,1% козьего молока в овечьем молоке (сыре) 10 мин/1.5 часа

Определение аллергического потенциала

RIDASCREEN^® Бета-лактоглобулин, 96 опр. 5 мг/л 30 мин/3 часа

Очень многие тест-системы RIDASCREEN FAST и RIDASCREEN уже включены в официальные методы Минздрава России, Управления ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству РФ и Российской академии сельскохозяйственных наук.

Так, например, разработаны "Методические рекомендации по экспресс-определению афлатоксина М1 в молоке, сухом молоке и сыре с помощью тест-системы "RIDASCREEN AFLATOXIN M1" МР №17/ФЦ3739, "Методические рекомендации по экспресс-определению афлатоксина М1 в молоке и сухом молоке с помощью тест-системы "RIDASCREEN FAST AFLATOXIN M1" 17ФЦ/3735, "Определение остаточных количеств левомицетина в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа" МУК 4.1.1912-04, "Методические указания по количественному определению антибактериальных препаратов в продовольственном сырье и продуктах питания животного происхождения методом конкурентного иммуноферментного анализа" МУК 5-1-14/1005

Для определения афлатоксина М1 в молоке и молочных продуктах международная организация по стандартизации и международная молочная федерация также рекомендуют метод конкурентного иммуноферментного анализа, соответственно, ISO 14675: 2003 и IDF 186:2003

Кроме того, подготовлен стандартный метод ISO 14501:1998, использующийся для исследования молока и сухого молока на афлатоксин М1 с помощью метода иммуноафинной очистки (колонки AFLAPREP M, RIDA Aflatoxin), с последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией со спектрофлуориметрической детекцией

Известно много вариантов постановки ИФА. Наибольшее распространение получил гетерогенный вариант иммуноферментного анализа, при котором антиген (определяемое соединение) или антитела фиксируется на твёрдой фазе, в качестве которой могут выступать полистироловый планшет, полистироловые бусины, пористая подложка или магнитный носитель

Для наглядности рассмотрим вариант гетерогенного конкурентного ИФА, реализованный в тест-системе RIDASCREEN FAST Афлатоксин М1

На рисунке 1 схематично показана лунка полистиролового планшета, в которой последовательно выполняются все стадии иммуноферментного анализа

Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован "антителами захвата", наработанными к антителам к афлатоксину М1 (антигену)

Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые или стандартные

растворы, препарат, содержащий антитела к афлатоксину М1 и препарат, содержащий коньюгат афлатоксина М1 с ферментом, дозируются в лунки планшета (см. Рисунок 2). При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы афлатоксина М1 и молекулы коньюгата, конкурируя между собой, связываются антителами в объеме раствора. В то же самое время, при инкубации происходит иммуносорбция антител к определяемому антигену "антителами захвата" на поверхности лунок планшета (см. Рисунок 3).

На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы коньюгата (см. Рисунок 4).

После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий субстрат и хромоген. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы коньюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в

качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции (см. Рисунок 5).

После определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на

желтый (см. Рисунок 6)

Интенсивность окраски в лунках ИФА-планшета обратно пропорциональна концентрации афлатоксина М1, другими словами - чем насыщенней цвет растворов, тем меньше концентрация афлатоксина М1 в молоке (см. Рисунок 7)

Обработка результатов измерений может выполняться вручную, либо с помощью специализированного программного обеспечения, например, RIDA Soft.

ИФА-фотометр, снабженный фильтром на 450 нм
Одноканальные автоматические пипетки на 50 мкл и на 200 - 1000 мкл
8-канальные автоматические пипетки на 50 мкл и 250 мкл (рекомендуется)
Наконечники для автоматических пипеток
Стеклянная посуда
Центрифуга
Пробирки с притертыми стеклянными или винтовыми пробками

Рисунок 7. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы RIDASCREEN FAST Афлатоксин М1

Экспрессность и высокая производительность;
Простота пробоподготовки и анализа, удобство работы;
Высокая чувствительность и специфичность метода;
Гибкость метода - анализ может быть проведен по выбору вручную или автоматически;
Низкая стоимость требующегося оборудования и расходных материалов, небольшие затраты на постановку и поддержку метода;
Освоение метода не требует специальных знаний.

СанПиН 2.3.2.1078-01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. - М.: Минздрав России, 2002.
Иммунологические методы (под редакцией Г.Фримеля).1987г.; Стр.162, 163-170.
Галкин А. Теория и практика иммуноферментного анализа. - Био. - Июнь - 2003, с. 33.

Автор статьи:
А.В. Галкин, к.х.н.
Директор ООО "Стайлаб"
e-mail: stylab@yandex.ru, mail@stylab.ru
тел: (495) 707 28 68, 729 17 04; факс (495) 707 28 68